11种鲈形目鱼类ITS2特征及系统应用

ITS2 (Internal transcribed spacer 2)是位于核糖体5.8S和28S基因之间的非编码序列。为了探讨该片段的多样性特征以及进化模式,本研究选取了鲈形目(Perciformes) 5科11种鱼类为研究对象,共获得了444条ITS2克隆序列,其长度范围为332～515 bp。比较种内不同序列的长度发现,金带细鲹(Selaroides leptolepis)在种内存在24 bp的差异,剑鱼(Xiphias gladius)在种内存在32 bp的差异,这2种鱼类的差异较为明显;其余9种鱼类的长度相对比较保守,长度差异小于14 bp。依据11种鱼类的保守位点数、变异位点数、简约信息位点数、单倍型数、保守位点比例、单倍型多样性指数、核苷酸多样性等特征分析发现,种内存在着不同程度差异,特别是金带细鲹的ITS2序列存在着Type A、Type B和Type C 3种类型,各类型间差异较大。根据序列的多样性特征推断,金带细鲹和剑鱼的进化方式为非协同进化;蓝圆鲹(Decapterus maruadsi)、大甲鲹(Megalaspis cordyla)、吉打副叶鲹(Alepes djedaba)和日本竹筴鱼(Trachurus japonicas)的长度和变异位点均存在着一定程度的差异,但差异并不明显,视为不严格的协同进化;泰拉鰆鲹(Scomberoides tala)、布氏鲳鲹(Trachinotus blochii)、尖吻鲈(Lates calcarifer)、射水鱼(Toxotes chatareus)和军曹鱼(Rachycentron canadum) 5种鱼类为协同进化;另外,协同和非协同进化状态与分类系统没有相关性。序列比对发现,大甲鲹种内存在着由协同进化方式演变为非严格的协同进化方式的过度序列;在金带细鲹的3个不同个体中,序列间存在着从协同进化、非严格的协同进化演变为非协同进化的3种进化方式。基于ITS2序列构建的11种鱼类的邻接系统树显示,每种鱼类的克隆都分别按种单独聚为一支,鲹科7属鱼类各属也是单独聚支,表明ITS2不仅可以用在种类的分子鉴定,同时也可以作为分子标记应用于鲹科和属级水平的系统关系研究。     

国内虹鳟代表性养殖群体的高通量SNP芯片检测及遗传分析

本研究旨在对国内虹鳟(Oncorhynchus mykiss)代表性养殖群体开展全基因组水平的遗传评估。利用57K单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)芯片,检测了来自不同地域的6个虹鳟养殖群体样本共计48尾,包括黑龙江虹鳟、黑龙江金鳟、四川虹鳟、四川金鳟、北京虹鳟和北京金鳟,共获得有效SNP位点50201个,在中国虹鳟中的多态比例达到97.7%,表明该芯片虽然基于美国和挪威虹鳟群体设计,但对中国群体同样具有良好的适用性。各群体最小等位基因频率均值为0.240~0.267,与国外主流养殖群体相近,黑龙江虹鳟、四川虹鳟和北京虹鳟群体内遗传多样性丰富,多态位点比例为83.6%~84.9%,与国外主流养殖群体相近,而黑龙江金鳟、四川金鳟和北京金鳟,多态位点比例相对较低,在60.2%~76.9%范围内。应用6个中国虹鳟群体和2个美国虹鳟群体数据开展系统发育分析、主成分分析和群体遗传结构STRUCTURE分析,结果显示8个群体可分为3个祖源类群,其中3个金鳟群体为遗传联系较紧密的一个类群,黑龙江虹鳟和北京虹鳟为一个类群,而四川虹鳟与2个美国虹鳟群体为一个类群,部分中国养殖群体中有显著离群个体存在,表明群体遗传背景不均一。本研究表明,高密度SNP芯片在我国虹鳟养殖群体遗传分析中具有广泛的应用前景,能够为种质资源评估、本土化良种培育、制种和引种工作提供基因组水平的参考信息。     

美国大灵芝（Ganoderma oregonense）转录组SSR位点的生物信息学分析

为了解美国大灵芝（Ganoderma oregonense）转录组中的简单重复序列（simple sequence repeat,SSR）位点信息,并为开发灵芝分子标记辅助育种技术奠定基础,将高通量转录组测序获得的美国大灵芝转录组数据通过Trinity软件拼接组装,再利用MISA软件分析其SSR位点信息。随后采用Primer 3根据SSR位点设计特异性鉴别引物,并以灵芝DNA为模板,对其有效性进行验证。共获得65 064条单基因簇（unigene）,在其中2 981条unigene中检测到3 380个符合软件参数的SSR位点,发生频率为5.19%,平均分布距离为12.60 kb。美国大灵芝转录组SSR位点总长度为52 168 bp,平均长度为15 bp。单核苷酸、三核苷酸是美国大灵芝转录组SSR的主要重复类型,分别占总SSR的35.33%和38.67%。SSR基元重复次数范围为5~73次,其中5次重复的发生次数最高。SSR重复基元共有98个类型,其中C/G是最常见的重复基元,比例为17.72%,其次是A/T,比例为17.60%。针对3 380个SSR位点设计出2 324对SSR引物,随机选择15对引物对3种灵芝栽培品种进行PCR扩增,10对引物可稳定扩增出条带,其中8对在3个灵芝栽培品种中表现出多态性。说明美国大灵芝转录组SSR位点多态性丰富,对灵芝的功能基因挖掘、分子标记辅助育种开发以及遗传多样性分析等具有重要意义。     

荒漠刺叶墙藓DNA的提取及PCR扩增反应条件

采用改进CTAB法、NaOH法和直接PCR法(direct PCR amplification)提取藓类生物结皮中刺叶墙藓(Tortula desertorumBroth.)基因组DNA,比较其分离效果以及ISSR扩增效果。结果表明:改进CTAB法提取的基因组DNA质量好、纯度高,ISSR扩增反应效果好。直接PCR法一旦体系建立,则是最简易快速、经济高效的模板制备方法,适于植株矮小、生物量很小的荒漠藓类植物个体模板DNA的制备。利用改进CTAB法获得的基因组DNA作为模板,对ISSR反应组分浓度及反应程序中的一些重要参数进行摸索和优化实验,建立了刺叶墙藓最优ISSR反应体系。反应总体积为20μL,各反应组分终浓度为:2μL10×Buffer,2 mM Mg2 ,0.1 mM dNTPs,0.2μM引物,10~40 ng模板DNA,1U Taq酶。扩增程序为:94℃4 min,1个循环;94℃45 s,退火温度(Tm)45 s,72℃1 min,35个循环;72℃7 min,1个循环;4℃保存。刺叶墙藓是组成古尔班通古特沙漠藓类生物结皮的优势种,研究结果为进一步开展刺叶墙藓遗传多样性的研究奠定了基础。     

大白猪肿瘤坏死因子α基因启动子区多态性及其对mRNA表达水平的影响

肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)基因在机体固有免疫和炎症反应中发挥重要作用,本研究旨在分析大白猪TNF-α基因启动子区C-791T多态性及其与基因表达之间的关系,为分析TNF-α基因启动子区C-791T突变的遗传学效应提供科学依据.本试验利用PCR-SSCP方法对201头大白猪TNF-α基因启动子区C-791T位点多态性进行检测,同时利用Real-time PCR方法分析TNF-α基因C-791T位点不同基因型在大白猪11个组织中的mRNA差异表达情况.结果表明,大白猪TNF-α基因启动子区-791 bp处存在碱基突变(C> T),并检测到3种基因型,分别为:CC、CT和TT.TNF-α基因在断奶仔猪脾脏、肺脏、胸腺和淋巴结等免疫器官中表达量均较高;TT和CT基因型个体在11个组织中TNF-α基因表达量普遍高于CC基因型个体,且在十二指肠及空肠组织中达到差异显著性水平(P <0.05).因此,TNF-α基因启动子区C-791T突变对该基因的mRNA表达水平产生显著影响,有必要将TNF-α基因启动子区C-791T位点多态性作为提升机体肠道病原菌抗性的遗传标记进行深入研究.     

北京黑猪PPARD基因G32E多态位点与脂肪沉积相关性状的关联分析

试验旨在研究猪过氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPARD)基因第1外显子上的错义突变位点G32E(g.61399G>A)多态性与北京黑猪脂肪沉积相关性状的关联。利用Sequenom质谱检测平台检测北京黑猪及多个中外猪种群体G32E位点的基因型,并分析该位点多态性与北京黑猪背膘厚及肌内脂肪的关联性。结果发现,在北京黑猪中,G32E位点GG基因型个体背膘厚性状极显著高于GA和AA基因型个体(P<0.01),与肌内脂肪含量的关联未达到显著水平(P>0.05)。在梅山猪和二花脸猪中,主要以A等位基因为主;而在中国地方猪种民猪、莱芜黑猪、丫杈猪及国外商品猪种杜洛克猪、长白猪和大白猪中,G等位基因频率高。初步认为PPARD基因G32E位点多态性对背膘厚性状有显著影响,对肌内脂肪含量性状没有影响。     

LAMP assay and rapid sample preparation method for on‐site detection of flavescence dorée phytoplasma in grapevine

In Europe the most devastating phytoplasma associated with grapevine yellows (GY) diseases is a quarantine pest, flavescence dorée (FDp), from the 16SrV taxonomic group. The on‐site detection of FDp with an affordable device would contribute to faster and more efficient decisions on the control measures for FDp. Therefore, a real‐time isothermal LAMP assay for detection of FDp was validated according to the EPPO standards and MIQE guidelines. The LAMP assay was shown to be specific and extremely sensitive, because it detected FDp in all leaf samples that were determined to be FDp infected using quantitative real‐time PCR. The whole procedure of sample preparation and testing was designed and optimized for on‐site detection and can be completed in one hour. The homogenization procedure of the grapevine samples (leaf vein, flower or berry) was optimized to allow direct testing of crude homogenates with the LAMP assay, without the need for DNA extraction, and was shown to be extremely sensitive.     

玉米细菌性枯萎病菌的环介导恒温扩增(LAMP)检测方法

为了提高口岸和基层实验室检疫和监测玉米细菌性枯萎病菌的准确性和工作效率,利用环介导恒温扩增技术(LAMP),根据内切葡聚糖酶(EGase)基因前导序列,设计2个内引物和2个外引物,对玉米细菌性枯萎病菌进行快速检测。结果表明,使用玉米细菌性枯萎病菌的近缘种或引致相似症状的病原菌菊欧文氏菌玉米致病变种Erwinia chrysanthemi pv.zeae、玉米内州萎蔫病菌Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis、燕麦假单胞菌Pseudomonas avenae、杓兰欧文氏菌Erwinia cypripedii检测其特异性,仅玉米细菌性枯萎病菌有扩增。LAMP检测灵敏度达到2 pg DNA,为普通PCR的100倍;与其它检测方法相比,LAMP方法检测时间短,效率高,不仅降低了设备投入,易于操作,而且具有较高的灵敏度和特异性,适合玉米细菌性枯萎病菌的现场检疫和大规模检测。     

东北地区亚洲玉米螟不同寄主植物种群线粒体基因遗传多样性

为了解不同寄主植物对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)寄主专化性及遗传多样性的影响,以东北地区取食4种寄主植物的亚洲玉米螟种群为研究对象,选取其线粒体COⅠ和COⅡ基因作为分子标记,通过序列比对分析,研究了亚洲玉米螟种群间的遗传多样性、基因流水平及分子变异。结果显示,亚洲玉米螟线粒体基因具有较丰富的遗传多态性;COⅠ和COⅡ基因总寄主植物种群Fu’s Fs检验结果分别为-1.82和-2.04,种群历史呈扩张趋势,基因流Nm分别为6.38和3.24,说明各种群间基因交流水平较高;遗传变异主要来自于种群内部;亚洲玉米螟的单倍型在BI树和NJ树上的分布拓扑结构与寄主植物间无对应关系。研究表明,取食不同寄主植物的亚洲玉米螟种群间的遗传多态性较高,基因交流频繁,且尚未发生遗传分化。     

航天诱变紫花苜蓿第一代植株(SP1)表型变异及基因多态性分析

采用正交设计优化紫花苜蓿(Medicagosativa L.)SSR-PCR反应体系,从17对SSR引物中筛选出6对扩增产物具有稳定多态性的引物,检测第1代植株的基因多态性。结果表明:4个紫花苜蓿品种德福(Defi)、德宝(Derby)、阿尔刚金(Algonguin)、三得利(Sanditi)共检测到25个等位基因,每对引物检测出2～8个等位基因,平均为4.17个。结合植株较高、叶色较深、叶片较大、多叶4个表型突变指标,检测经过表型变异筛选的植株等位基因频率及每个位点的多态性信息量(PIC),PIC在0.2216～0.8328之间变化,平均为0.6366。分析多态基因植株与表型变异的相关性,根据检测结果初步确定了13株突变植株,为后继世代遗传变异的多代跟踪及选育奠定基础。